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下載安裝Flash播放器（三）嗜粒細胞無形體核酸PCR檢測。
目前，國際推薦使用16S rRNA基因檢測方法，有條件的實驗室，可進一步選用熱休克蛋白基因groEL擴增方法。
1. DNA提取
用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白細胞及蜱研磨液提取DNA。最后，以AE緩沖液50μl抽濾以提高回收的DNA濃度。如采用血液白細胞層提取DNA，可明顯提高陽性檢出率。實驗時，應采集當地正常人血液同時提取DNA，作為PCR的陰性對照。
2. PCR擴增
（1）16S rRNA基因檢測：16S rRNA 高度保守，是PCR檢測最常用的擴增靶基因，巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異度，采用屬特異及種特異引物同時進行檢測。PCR檢測應分區進行，避免污染。使用引物序列見表1。
表1 巢式PCR檢測無形體及埃立克體16S rRNA基因常用引物
|
引物名稱 |
序 列 |
片段長度(bp) |
|
Eh-out1(AF414399) |
5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’ |
653 |
|
Eh-out2(AF414399) |
5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’ |
|
|
Eh-gs1(AF414399) |
5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’ |
282 |
|
Eh-gs2(AF414399) |
5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’ |
|
|
HGA1 |
5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’ |
389 |
|
HGA2 |
5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’ |
PCR反應混合物的準備按常規進行。第一輪反應采用外引物對Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10μl（白細胞提取的DNA可適當減少）。PCR反應體系總體積為25μl或50μl（需要進行PCR測序或克隆時，應適當擴大反應體系），其它成分的濃度按常規進行。反應程序如下：
94℃ 5min
40循環：94℃ 45sec
55℃ 50sec
72℃ 1min
72℃ 總延伸 5min
第二輪反應使用2對引物分別進行巢式PCR。2對引物分別是無形體屬及埃立克體屬通用內引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA種特異性引物（HGA1及HGA2）。檢測樣本取第一輪產物1-2μl為模板，陽性對照取0.5μl為模板。反應程序同第一輪反應。
（2）熱休克蛋白基因groEL擴增
與groEL基因的應用相比，16S rRNA基因的應用更為廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此，對于診斷及菌株的鑒定，groEL基因均具有重要意義。該基因擴增使用巢式PCR，引物序列見表2。
表2 groEL基因擴增常用引物
|
引物名稱 |
序 列 |
退火溫度 |
片段長度bp) |
|
HS1 |
5’-TGG GCT GGT A（A/C）TGA AAT |
52℃ |
1431 |
|
HS6 |
5’-CCI CCI GGI ACI A（C/T）ACC TTC |
||
|
HS43 |
5’-AT（A/T）GC（A/T） AA（G/A）GAA GCA TAG TC |
55℃ |
HGA480 |
|
HS45 |
5’-ACT TCA CG（C/T）（C/T）TCA TAG AC |
HME528 |
DNA提取同上。PCR檢測時，反應混合物的準備按常規進行。DNA模板量同16S rRNA基因檢測。巢式PCR第一輪反應采用外引物對HS1及HS6。
反應程序如下：
3循環：94℃ 1min
48℃ 2min
70℃ 90sec
37循環：88℃ 1min
52℃ 2min
70℃ 90sec
68℃ 總延伸 5min
第二輪PCR引物采用HS43及HS45。檢測樣本取第一輪產物1-2μl為模板，陽性對照取0.5μl為模板。反應程序同第一輪反應。反應程序同第一輪反應，但退火溫度由52℃改為55℃。
3．測序及分析
對擴增產物進行測序并進行同源比較，分析當地流行株與其它地區的變異性。