DNA元件的標準化設計。為了最大化的降低對?DNA?片段的重新合成，提高對已有?DNA?片段的利用率，合成生物學的一個重要研究方向是推進合成片段（生物元件）的標準化。上述提及的?BioBrick?就是標準化的實現形式之一，是合成生物學領域最早建立的?DNA?標準化組裝方法。但是?BioBrick?法在被連接的元件之間留下的痕跡不利于蛋白元件的組裝。BglBrick?法就是為解決?BioBrick?的缺陷而產生的標準化策略。我國王金課題組用歸位內切酶代替常規的?II?型限制性內切酶建立了?iBrick?標準，同時基于?CRISPR/Cpf1?技術開發了?C-Brick?拼接標準。基于?IIS?型限制性內切酶的Golden Gate?標準，包括?MoClo和?GoldenBraid 2.0，也能通過統一的方式進行元件的組裝。針對?Golden Gate?等標準的不足，王金課題組建立了?MASTER?連接法以實現更大片段的無縫克隆。此外，還有與?iBirck?標準類似的?HVAS?法，與?MASTER?類似的?GreenGate?法等。不同的實驗室如果都按照上述的方式對生物元件進行標準化，將能促進生物元件的流通和共享，提高復雜生命系統合成的效率。

胞內組裝

盡管體外拼裝的片段大小可達幾百?kb，但是所得的量往往不足以進行后續實驗，需要使用大腸桿菌等進行擴增。對于?Mb（百萬堿基對）級別的體外組裝尚未見報道，即使假設能體外組裝成功，可能也無法導入到大腸桿菌內進行擴增。而枯草芽孢桿菌、酵母及工程改造的部分細菌（超表達?T4 DNA?連接酶或整合?λRed?重組酶）等微生物本身就可以介導?DNA?的胞內重組連接，可直接將需要組裝的?DNA?片段導入這些宿主細胞內進行組裝。酵母作為常用的?DNA?重組宿主，其高效的同源重組性能早在?40?多年前就已被發掘。1991?年，Silverman?等報道酵母可以實現長達?2?Mb?的人工染色體組裝。而?2010?年，Gibson?等報道合成世界上第一個人造生命體，其長達?1.1?Mb?的合成基因組也是由酵母拼裝獲得。借助于酵母強大的同源重組能力，Sc2.0?項目（酵母基因組合成計劃）利用?SwAP-In?的方法實現了天然染色體的置換，獲得完全合成的人工染色體。2018?年?8?月，Shao?等報道其將釀酒酵母?16?條染色體合并為?1?條長度達?11.8?Mb?的染色體，并獲得有正常功能的單染色體酵母菌株。帶有?1?條染色體的酵母，可作為一個新的研究平臺，增進我們對染色體重組、復制和分離機制的解析，具有重要的意義。此外，該研究的結果也說明釀酒酵母對染色體長度驚人的容忍度（至少可以長達?12?Mb），這為利用酵母構建高等生物的超長染色體提供了理論依據，有利于后續?GP-write?項目（基因組編寫計劃）的開展。

相關文章