酶促從頭合成法

目前亞磷酰胺法是商業(yè)化?Oligo?合成的主流方法，但其合成的長度限制在?200?nt?左右，而且合成過程中亦會大量使用有毒化學(xué)試劑。由于在合成準確性及不需要使用毒性化合物等方面的潛在優(yōu)勢，酶促合成方法受到了越來越多的關(guān)注。酶促法從頭合成寡聚核苷酸的提出至少可以追溯到?20?世紀?60?年代。與化學(xué)法相比，酶促法的作用條件溫和，對?DNA?的損傷較少，有助于準確性的提高，同時減少了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，可實現(xiàn)更長?Oligo?的合成。然而，酶促法的發(fā)展緩慢，至今未能實現(xiàn)商業(yè)化。根據(jù)?Jensen?和?Davis對?DNA?酶促從頭合成發(fā)展的總結(jié)，末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的酶促合成法是較好的選擇，但還需要更進一步優(yōu)化。TdT?介導(dǎo)的?DNA?合成技術(shù)開發(fā)中首先需要解決單個?dNTP?添加后的終止效率及末端重新活化的問題。近期，Palluk?等提出了一種解決方案，他們將?dNTP?通過可光誘導(dǎo)剪切的連接子與?TdT?連接，所得?dNTP-TdT?復(fù)合物可在?10—20?s?的時間完成?DNA?鏈的延伸，而且可以重復(fù)進行，實現(xiàn)特定?DNA?鏈的合成。該方法將為具有實際應(yīng)用價值的酶促?DNA?合成法的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

合成?DNA?拼裝技術(shù)

受當前合成技術(shù)的限制，目標基因組只能以短鏈?Oligo?的形式得以從頭合成，依賴后續(xù)的逐步拼接才能獲得。根據(jù)原理區(qū)別，以下對現(xiàn)有的?DNA?拼接技術(shù)進行了分類總結(jié)。

胞外組裝

根據(jù)組裝片段的大小、序列特性、是否接受額外序列殘留等，目前有眾多的策略可以采用。而眾多體外?DNA?組裝技術(shù)的共同點在于均需要工具酶的使用，以實現(xiàn)?DNA?鏈的切割、單鏈黏性末端的產(chǎn)生、雙鏈連接及缺口的補齊等。本文根據(jù)所用工具酶體系的不同將其歸為?5?類。

基于DNA聚合酶的策略。該方法首先合成有互補配對重疊區(qū)的?Oligo，利用?PCR?擴增的原理，可以對有互補重疊區(qū)的?Oligo?進行延伸連接獲得小?DNA?片段，然后小?DNA?片段以重疊?PCR?的方式進行逐步連接獲得目的?DNA?片段，以其作為模板，進一步?PCR?擴增可以大量獲得目的片段（圖?2a）。此方法（polymerase cycling assembly，PCA）無須依賴額外的?DNA?連接酶，直接從人工合成的?Oligo?開始組裝，操作簡單、快速。Stemmer等曾用此法實現(xiàn)基因及質(zhì)粒的一步拼裝。Smith?等則通過增加?Taq?連接酶的步驟用此法合成了?ФX174?噬菌體的基因組。

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