TALENs?技術

ZFN?技術將基因編輯引領進了不再單純依賴自然發生?DSBs?的時代，但其存在很大的局限性，如成本高、難以實現多靶點編輯等。而?TALE（transcription activator like effector）基序的發現催生了第二代基因編輯技術——TALENs（TALE nucleases）。TALEN?的構造與?ZFN?類似，由?TALE?基序串聯成決定靶向性的?DNA?識別模塊，與?FokI?結構域連接而成。與?ZF?基序不同，一個?TALE?基序識別一個堿基對（圖?1b），因此串聯的?TALE?基序與所識別的堿基對是一一對應的關系。研究發現，對于相同的靶點?TALENs?有與?ZFNs?相同的切割效率，但是毒性通常比?ZFNs?的低，另外其構建也比?ZFNs?容易。然而，TALENs?在尺寸上要比?ZFNs?大得多，而且有更多的重復序列，其編碼基因在大腸桿菌中組裝更加困難。

RNA引導的基因編輯技術

CRISPR/Cas9??技術

CRISPR/Cas?系統原本是細菌和古菌進化出來用于抵御外來病毒及質粒?DNA?的適應性免疫系統。II?型CRISPR/Cas?系統依賴于外源?DNA?片段在規律成簇的短間隔回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）位點整合，其經過轉錄及剪切后產生短的?CRISPR RNAs（crRNAs），crRNA?與反式轉錄的?crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）退火結合，然后引導?Cas9（CRISPR associated protein 9，Cas9）蛋白介導序列特異性的外源?DNA?降解。Jinek?等發現?Cas9?發揮靶向切割作用所依賴的?crRNA?和?tracrRNA?可以融合為一體，作為?sgRNA（single guide RNA）（圖?1c）。隨后，若干研究組陸續報道?CRISPR/Cas9?系統可用于人類細胞的靶向基因編輯。與?ZFNs?和?TALENs?技術相比，CRISPR/Cas9?的設計要簡單得多，而且成本很低，對于相同的靶點，CRISPR/Cas9?有相當甚至更好的靶向效率。

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