底物選擇性重設計

酶催化中心的精確空間結構賦予其高度的底物特異性等特點。面對紛繁龐雜的底物譜，從自然界中篩選新酶開發的速度遠不能滿足當今合成生物學需求，因此改變酶的底物特異性是計算蛋白質設計中應用最廣泛的方向之一。

2015?年，Baker?課題組通過計算設計聚甲醛酶，將單碳甲醛分子固定至三碳單元的二羥基丙酮中，從而實現核心代謝步驟，首次通過催化元件設計指導新型代謝通路合成。他們以苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase，BAL）為起點，利用?RosettaDesign?以及?Foldit?重新設計?BAL?的苯甲醛結合口袋以增加其對甲醛的特異性，獲得?7?個突變氨基酸組成的聚甲醛酶（Formolase，FLS）。該酶對聚甲醛反應的催化效率與原始?BAL?相比增加?100?倍。在甲酸轉化為二羥丙酮磷酸鹽途徑中，由甲酸直接還原為甲醛難度很大。為實現甲酸轉化，Baker課題組先將甲酸活化為甲?；?-CoA，降低熱力學障礙。隨后通過?BRENDA?數據庫搜索挖掘能夠將甲酰基?-CoA?還原為甲醛的酰化醛脫氫酶，并將乙酰輔酶?A?合酶與酰化醛脫氫酶串聯催化甲酸轉化為甲醛。通過上述設計的聚甲醛酶，將甲酸最終轉化為磷酸二羥丙酮。這項工作充分證明了酶分子底物重設計能夠有效引導新型代謝途徑設計。

酶分子熱穩定性設計

改善酶熱穩定性可提高異源宿主表達量，提高溫和條件下催化元件活性，并增強酶對嚴苛工業條件（有機溶劑、高溫、極端?pH?值等）的耐受力。在蛋白質熱穩定性改造方面，使用傳統蛋白質進化的方法，蛋白質熔解溫度的提高通常小于?15℃。而通過對蛋白質整體結構的能量計算指導的計算機設計方法則可以突破該局限，甚至可以使蛋白質的熔解溫度提高超過?35℃?以上的水平，獲得具有超熱穩定性的蛋白。

目前，針對酶分子熱穩定性改造已發展出多種策略和算法，其預測能量與數據庫值擬合程度最高相關系數（R?值）可達到?0.73（Foldx?程序）。Weiss?團隊利用?SCADS?策略（Statistical, Computationally Assisted Design Strategy，SCADS）對馬兜鈴烯合成酶進行環境能量打分，檢測氨基酸側鏈與周圍骨架、側鏈，以及所在環境的相互作用。通過環境能量評估篩選?12?個打分最高的氨基酸進行突變，熔融溫度由?38℃?提升至?83℃。Janssen?課題組通過?FRESCO?策略（Framework for Rapid Enzyme Stabilization by Computational libraries，FRESCO）對檸檬烯環氧化物水解酶進行熱穩定性突變體文庫構建，通過結合?10—12?個單點突變，組合突變體的熔融溫度從?50℃?提高至?85℃，且酶的催化活性增強，半衰期延長大于?250?倍。他們還利用?FRESCO?策略對鹵代烷脫鹵酶（haloalkane dehalogenase）LinB?進行熱穩定性計算。12?個穩定突變疊加導致?LinB?突變體熔融溫度增加?23℃，并且在?60℃?下半衰期超過?200?倍。此外，為了提高鹵代醇脫鹵素酶（halohydrin dehalogenase）在有機溶劑中的耐受性，Janssen?課題組利用?FRESCO?策略確定了?218?個突變點和?35?個二硫鍵，具有預測的穩定效應。結果顯示，組合突變體（HheC-H12）熔融溫度提高?28℃，對共溶劑的抗性顯著增加。2016?年，Fleishman?團隊開發了一種聯合計算策略（protein repair one stop shop，PROSS），設計帶有?51?個突變的乙酰膽堿酯酶（hAChE）突變體，通過結構分析發現該突變體可以顯著改善蛋白質的核心堆積、表面極性及骨架剛性。與野生型相比，該突變體在大腸桿菌中表達水平高出?2?000?倍，熱穩定性提高?20℃。

多肽的末端功能化對蛋白質生化性質具有非常重要的影響。通過對?C?端的特異性修飾可以使多肽的體內代謝半衰期延長、免疫原性降低或毒副作用減少。由于多肽結構的復雜性，化學修飾步驟多、產率低、難度很大。2016?年，中國科學院微生物研究所研究團隊與荷蘭格羅寧根大學以及?Enzypep?公司合作，采取一種“FRESCO?與一致性分析聯合計算”策略對多肽酰胺酶進行了工程化改造，成功設計了一個經過高度改造的多肽酰胺酶突變體?PAM12A（包含?12?個突變點）。PAM12A?具有極高的熱穩定性（熔解溫度達到?76℃），并且可以在乙腈、丙酮等多種無水溶劑環境中保持數天的穩定活性。實驗結果表明，PAM12A?可以催化包括甲酯化、羥胺化、甲胺化、胺化在內的多種不同的多肽修飾反應，且不受多肽本身序列和?C?端原功能基團的限制。