人工基因線路設(shè)計(jì)的挑戰(zhàn)

使用人工基因線路執(zhí)行控制功能時(shí)，需要將該線路裝載到不同的底盤生物中。不同領(lǐng)域的應(yīng)用對(duì)底盤生物需求的多樣性要求人工基因線路對(duì)底盤生物的適應(yīng)性。為了達(dá)到此目標(biāo)，需要對(duì)人工基因線路進(jìn)行“模塊化”設(shè)計(jì)。“模塊化”是合成生物學(xué)元件的核心屬性之一，設(shè)計(jì)目標(biāo)是將生物系統(tǒng)拆解為功能上相互獨(dú)立的模塊，并保證模塊間的拼裝不會(huì)導(dǎo)致模塊功能的改變。模塊化設(shè)計(jì)能使構(gòu)建的生物系統(tǒng)像電子系統(tǒng)一樣進(jìn)行規(guī)模擴(kuò)展和尺度放大，因此合成生物學(xué)領(lǐng)域的大量工作都注重模塊化元件的開(kāi)發(fā)。然而，事實(shí)遠(yuǎn)比設(shè)想中復(fù)雜。基因回路并不能嚴(yán)格地和宿主細(xì)胞隔離，而是與細(xì)胞的生理狀態(tài)耦合形成一個(gè)整體，人工基因線路會(huì)對(duì)細(xì)胞生理產(chǎn)生一些不可預(yù)知的干涉性影響，而這些干涉性影響也使理論上“模塊化”的生物元件和基因線路失去了可預(yù)測(cè)性，不再“模塊化”。這就導(dǎo)致在一種生物中精細(xì)刻畫過(guò)的元件性質(zhì)并不能在另一種生物中直接成立，因?yàn)樵坏┟撾x了刻畫時(shí)的細(xì)胞生理狀態(tài)，其行為就有可能偏離預(yù)期。如果不能克服這個(gè)問(wèn)題，合成生物元件就不能像電子元件一樣使用簡(jiǎn)單元件逐步搭建復(fù)雜線路，而是需要耗費(fèi)大量時(shí)間和精力對(duì)單個(gè)底盤生物中的元件進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的優(yōu)化。目前，人工基因線路的設(shè)計(jì)挑戰(zhàn)主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：①人工基因元件過(guò)表達(dá)引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)壓力和細(xì)胞毒性；②細(xì)胞體內(nèi)存在一些會(huì)影響人工基因線路功能的特殊生理機(jī)制。

人工基因線路過(guò)表達(dá)引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)壓力和細(xì)胞毒性

細(xì)胞利用有限的資源完成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、能量代謝、DNA?復(fù)制、細(xì)胞分裂等諸多生理過(guò)程。為了優(yōu)化自身的生長(zhǎng)，細(xì)胞需要根據(jù)環(huán)境平衡分配這些資源。當(dāng)人工基因線路的加入打破了這種平衡，就可能引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)壓力（burden），影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。細(xì)胞的生長(zhǎng)壓力主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：①人工基因線路在蛋白表達(dá)過(guò)程中占用了底盤細(xì)胞的?RNA?聚合酶和核糖體，以及相關(guān)的輔酶、能量等資源。②過(guò)量表達(dá)蛋白還可能引起細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，激活一些細(xì)胞應(yīng)激途徑如?ppGpp?等。除了生長(zhǎng)壓力，人工基因線路還可能帶來(lái)細(xì)胞毒性（toxicity）。與生長(zhǎng)壓力不同，細(xì)胞毒性產(chǎn)生的原因是人工基因線路調(diào)控過(guò)程中的脫靶效應(yīng)對(duì)底盤細(xì)胞的正常生理活動(dòng)產(chǎn)生的干擾，而非由于對(duì)細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)資源的占用。

當(dāng)?shù)妆P細(xì)胞因?yàn)樯L(zhǎng)壓力或細(xì)胞毒性而生長(zhǎng)減緩時(shí)，會(huì)反過(guò)來(lái)對(duì)其內(nèi)部人工基因線路的可預(yù)測(cè)性和遺傳穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，基于?TetR?家族阻遏蛋白設(shè)計(jì)的元件中，一些阻遏蛋白可能會(huì)與底盤細(xì)胞基因組上非特異靶位點(diǎn)的結(jié)合，從而影響底盤細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也降低了這些元件的可預(yù)測(cè)性。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，人工基因線路的序列可能產(chǎn)生各種隨機(jī)突變。通常這些突變帶來(lái)的影響非常小，但如果某種突變體為其所在的細(xì)胞帶來(lái)了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，就會(huì)很快占據(jù)群落的主體，使人工基因線路在群體層次上失效。例如，一種基于群體感應(yīng)設(shè)計(jì)的、控制細(xì)胞群體大小的元件在傳代培養(yǎng)?3—6?天后，就由于逃脫調(diào)控的突變體發(fā)生大量增殖而失效。

許多已經(jīng)廣泛使用的優(yōu)質(zhì)元件也因?yàn)樽陨淼募?xì)胞毒性限制了其發(fā)揮和推廣。例如，CRISPRi-dCas9（CRISPR interference-dCas9）調(diào)控系統(tǒng)被認(rèn)為是優(yōu)秀的可編程的調(diào)控元件，目前已被廣泛用于基因線路的構(gòu)建。然而，隨著?dCas9?表達(dá)量升高，細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)明顯的遲滯。一些研究者認(rèn)為該毒性來(lái)源于?CRISPR?的脫靶效應(yīng)。因而在?CRISPRi-dCas9?的實(shí)際使用過(guò)程中，研究者需要耗費(fèi)大量精力來(lái)平衡轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)關(guān)的正面影響與其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)面影響。合成生物學(xué)的元件設(shè)計(jì)最終要針對(duì)下游應(yīng)用問(wèn)題進(jìn)行調(diào)整，而下游應(yīng)用需要宿主細(xì)胞健康、快速生長(zhǎng)，因此元件的細(xì)胞毒性將是合成生物學(xué)走向應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題之一。

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