單細(xì)胞光譜檢測技術(shù)的類型

代謝物是細(xì)胞中基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，也通常是細(xì)胞表型與功能的最直接載體，因此代謝物組的檢測，包括代謝狀態(tài)的識別，是細(xì)胞功能檢測最直接、最有效的手段之一。目前在人工細(xì)胞測試的流程中，通常用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS）或核磁共振（NMR）對細(xì)胞“群體”或“群落”進(jìn)行系統(tǒng)分析，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能的檢測。但是單個細(xì)胞尤其是單個微生物細(xì)胞的代謝物極為微量，而且難以像核酸那樣進(jìn)行擴(kuò)增，因此，受到現(xiàn)有質(zhì)譜、色譜與核磁檢測靈敏度的限制，單細(xì)胞代謝組分析目前仍然存在困難。此外，這些方法的前提通常是裂解細(xì)胞以提取或制備胞內(nèi)代謝物，因此難以和目標(biāo)單細(xì)胞的后繼培養(yǎng)或基因組與轉(zhuǎn)錄組分析直接對接。而單細(xì)胞光譜則是在特定時間、空間與狀態(tài)下針對一個單細(xì)胞采集的分子光譜，能夠體現(xiàn)與展示胞內(nèi)代謝物（組）的特征，而且測量過程可以是非侵入性、非破壞性乃至維持活體狀態(tài)，故通過光譜激活的細(xì)胞分選能夠?qū)⑻囟ü庾V的細(xì)胞分離出來，進(jìn)而與單細(xì)胞培養(yǎng)和各種破壞性的單細(xì)胞功能基因組分析直接對接。因此，單細(xì)胞光譜技術(shù)是克服上述挑戰(zhàn)的有效手段。

基于熒光光譜的細(xì)胞功能檢測。熒光光譜具有靈敏度高、特異性好、分析通量高等優(yōu)勢，是目前應(yīng)用最為廣泛的單細(xì)胞表型檢測技術(shù)之一。然而大多數(shù)細(xì)胞均沒有自熒光，通常需要設(shè)計(jì)熒光探針，對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。常用的細(xì)胞熒光探針包括小分子熒光染料和熒光蛋白等。部分小分子熒光染料能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部直接標(biāo)記目標(biāo)分子，如小分子酶熒光探針可對細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行檢測和成像。此外，小分子熒光探針也可通過連接抗體，特異性地標(biāo)記細(xì)胞表面抗原，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能檢測。熒光蛋白（如綠色熒光蛋白）是另一類重要的熒光探針，常作為報(bào)告基因與目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)，以檢測目標(biāo)基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況，從而刻畫基因表達(dá)的動態(tài)過程及其功能異質(zhì)性。熒光蛋白也可檢測細(xì)胞內(nèi)代謝小分子。例如，一系列特異性檢測評價(jià)輔酶?NADPH?的高性能遺傳編碼熒光探針?iNap，實(shí)現(xiàn)了在活體動物、活細(xì)胞及各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中對?NADPH?代謝的高時空分辨檢測與成像；可基因編碼的多巴胺熒光探針和新型乙酰膽堿熒光探針，能在果蠅、斑馬魚和小鼠中檢測內(nèi)源多巴胺和乙酰膽堿的動態(tài)變化。目前，基于熒光探針的細(xì)胞功能檢測已被廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位與轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白折疊、信號傳導(dǎo)、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用和細(xì)胞代謝動態(tài)過程檢測等研究領(lǐng)域。盡管基于熒光光譜的細(xì)胞功能檢測具備諸多優(yōu)點(diǎn)，但是，需要預(yù)知生物標(biāo)示物，需要對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記甚至是遺傳操作，以及通常只能同時檢測少數(shù)標(biāo)記分子等前提條件也從原理上限制了熒光檢測在生物元件挖掘與細(xì)胞表型檢測中的廣泛應(yīng)用。對于自然界中絕大部分的微生物細(xì)胞，其生物標(biāo)識物經(jīng)常未知，也沒有普適性的細(xì)胞標(biāo)記方法，因此熒光檢測的細(xì)胞類型適用范圍相對較窄。即使對于大腸桿菌、酵母等常見的底盤細(xì)胞，構(gòu)成細(xì)胞表型組的大部分表型，如各種底物的代謝活性、代謝產(chǎn)物譜、環(huán)境應(yīng)激性、細(xì)胞間互作等，通常也難以用一種通用的熒光標(biāo)記的方法來直接測量，往往需要構(gòu)建獨(dú)立的細(xì)胞熒光傳感器。而在細(xì)胞中導(dǎo)入基于熒光的胞內(nèi)傳感器，通常需要通過轉(zhuǎn)錄因子等的設(shè)計(jì)和改造，將特定代謝物含量等信息轉(zhuǎn)換為細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；這種對細(xì)胞進(jìn)行?DNA?轉(zhuǎn)化乃至遺傳操作的前提，限制了適用的細(xì)胞類型與應(yīng)用場景。尤其重要的是，出色的靶標(biāo)分子特異性與多靶標(biāo)同時檢測可能是相互排斥的，由于多色熒光之間的相互干擾，目前多個基因功能表型的同時檢測還無法廣泛應(yīng)用，難以實(shí)現(xiàn)針對表型組的“全景式”測量。